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新冠检测不建议报告CT值,原来是这些担忧!

2021-12-23 21:51:06
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本文来源:IVD从业者网


点评内容:原博士带你做检测



10月11日,发表在美国临床化学协会《临床化学》杂志上的一项新研究强化了AACC的建议,即不要使用周期阈值(CT值)来确定SARS-CoV-2 PCR检测的性能。

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今年早些时候,AACC发表了一份公开声明,建议在管理 COVID-19 患者时不要在 PCR 检测中使用 Ct 值。它指出,定量检测的验证更为复杂,需要更严格的测试来确保性能,例如确定量化的下限,而不是检测的下限。

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这项由LGC英国国家测量实验室的研究人员领导的独立研究,调查了在英国、比利时和韩国的三个实验室用PCR对6000多名接受SARS-CoV-2检测的患者。

研究小组利用世界卫生组织建议的Ct截止25作为测试结果,发现临床敏感度从100%下降到16%到90%之间,这取决于患者群体。

研究人员查看了另外732个实验室,发现根据实验室的不同,单个Ct值可以对应不同的病毒载量。

该小组的负责人吉姆·哈格特(Jim Huggett)在一份声明中说,虽然Ct值可能有助于流行病学评估,但"应该避免将这些值作为衡量个人患者分层或...分析性能目标。

他说:"如果要进行量化,就应该探索根据适当标准的校准品来实现。



AACC提出影响CT值的原因

在COVID-19大流行期间,许多RT-PCR检测被FDA授权用于紧急使用,或作为实验室开发的新冠核酸定性检测试剂(LDT)进行验证。然而,美国一些卫生保健提供者和公共卫生机构要求实验室报告数字CT值以及标本检测到新冠核酸时的定量结果。
根据临床和实验室标准研究所(CLSI), CT 值是 "扩增仪器在背景之上可检测所需的周期数"。换句话说,CT 值是放大目标序列的荧光探头信号>用户验证期间确定的最小检测级别的zui低 PCR 周期数。较低的 CT 值与测试样本中目标病毒序列(复制号)的较高数量相关。
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根据统一术语数据库,CLSI 和 ISO 15189 指定了三个检测阶段:分析前、分析中和分析后。影响三个阶段中每个阶段 CT 值的因素如下表。



分析前

导致 CT 值变化的各种分析前环节,包括患者准备、生物差异、标本类型以及运输和储存(表 1)。

因素解释

表1.影响分析前CT值的因素



患者准备
在前鼻孔、中叶或鼻咽收集之前不去除多余的粘液,或在吃完食物之后未做漱口,都可能导致CT不准确的结果。
暴露和标本采集之间的时间
如果采集标本太早(例如暴露后前 3 天内)或太晚(例如症状发生后 >7 天),则可以得出假阴性结果。
标本收集有效率
不规范的标本采集可能导致结果不准确
生物差异
左右鼻孔、一天中的时间、患者年龄和生物地理祖先 (BGA) 之间的差异也会影响结果
媒介
结果可能因介质而异(例如干拭子、PBS、病毒运输介质、通用运输介质)
标本类型
结果可能因标本来源、取样部位而异(例如鼻拭子、咽拭子、唾液、痰等)
运输和储存
运输条件和温度可能会影响结果
标本年龄
应定义标本稳定性。如果收集和测试之间的时间超过稳定窗口,结果可能不准确


分析中

影响实际检测期间 CT 值的因素包括提取效率、荧光探针选择和试剂批次差异(表 2)。

因素解释

表2. 影响分析中CT值的因素



核酸回收效率
(非萃取方法)
缺乏浓缩能力,潜在的抑制和基质效应会影响结果
核酸提取效率
(提取方法)
不同程度的萃取效率和基质效应会影响结果
抑制检测
没有可用的对照来检测检测抑制可能产生假阴性结果或假高CT值
基因目标
(多个与单个)
CT值可能因基因靶点及其不同的放大动力学而不同,导致相同或不同标本的结果差异
荧光检测设计
用不同荧光团标记同一基因靶点的探针将增加结果的可变性
变异的影响
引物/探针的结合可能会受到变异的影响,导致CT值的改变
定义周期阈值
根据CT阈值的定义(例如,使用固定于CT值的校准器)或阈值的计算(例如,手动vs.自动化),可能会出现假阳性和阴性结果。
认证参考物质
缺乏认证的参考物质,如校准器,使得确认结果的准确性和验证作为定量LDT的分析具有挑战性
CT值的平台差异
平台有不同的敏感性和截止值。没有建立国际单位。因此,结果无法跨平台标准化
CT值范围可靠性
由于缺乏准确性,不应报告线性范围以外的CT值
试剂批间差
CT值可能因试剂批次而异。除非新试剂批次是用校准过的或先前描述过的材料来验证的,否则变化的程度是未知的
人员和操作误差
结果可能会因操作人员和一天中的时间而不同,特别是手动方法


分析后

在分析后的过程中,除检测靶标、可报告单位和检测目标等因素外,CT值还会传递给医疗保健提供者(表3)。

因素解释

表3.影响 检查后CT值的因素



检测目的
CT值的解释和使用取决于检测目的,如筛查、监测、诊断、监测、复工、术前、出院管理、传染性等
检测顺序
不鼓励用不同的基于pcr的检测方法纵向监测给定的患者,因为分析之间的可变性
传染性与病毒检测
病毒检测不等于传染性。表明感染病毒的CT值范围需要通过细胞培养研究确定。
患者具体因素
免疫和/或接种疫苗情况可能会影响CT值的效用
可报告单位
CT(周期数)、ng/uL、TCID50/mL、基因组拷贝数/mL、RNA NAAT检测单位(NDU)/mL之间缺乏相关性,可能使结果解释复杂化
手动操作
手工方法更容易出现错误(例如,数据输入错误),特别是在没有遵循质量步骤的情况下
趋势
对于意外变化(即CT相对于其他测量值的显著变化)缺乏LIS或质量标志可能会影响结果
再感染/复发
可能发生相同或不同变异的继发性感染,CT值的解释尚不清楚
检测目标
PCR-靶标丢失/靶标序列变异的初始和重复试验可能不一致


如果实验室必须报告CT值需注意

AACC承认实验室在CT值方面处于一个尴尬的位置。正如本文所总结的,报告CT值有许多局限性。虽然实验室意识到这些局限性,但也可能有来自临床同事的压力,要求报告或至少获得CT值。


对于决定报告CT值的实验室,AACC建议包括下面的解释性内容,以减少与报告CT值相关的潜在风险。AACC建议将这一意见附加到结果中,并在实验室报告中突出显示。实验室可能还需要考虑分析的特定CT范围,假设精度可接受,提供半定量结果(例如,低、中、高病毒RNA)和/或基于校准仪的delta计算CT值。


不鼓励使用CT值来指导患者管理,对于新冠病毒定性检测,尚未确定病毒载量与传染性的相关性。生物差异、样品充足性、接触时间、仪器、方法学、认证参考物质的缺乏以及监管因素等诸多因素都会影响新冠病毒定性检测中检测到的CT值。因此,AACC不鼓励报告或披露CT值以指导患者管理。


相关点评:
1.实时荧光PCR是定性方法

CT值因为有数值把原本半定量(就是定性)的实时荧光PCR方法包装成了定量的方法,但是定量方法的建立与验证比定性方法的建立与验证更加严格和复杂,参见GB/T27417-2017 合格评定 化学分析方法确认及验证指南。目前实时荧光PCR方法的建立和验证都是参照定性方法的参数。

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2.CT值不具有可比性

相同条件下同一次实验的2个样本的CT值具有比较的意义。但是,CT值可以受到引物探针设计、荧光基团、扩增效率、反应体系、仪器平台、软件优化等一系列因素影响,导致CT值无法作为一个恒定的量值进行相互比较。另外,只有在实时荧光PCR方法的有效线性范围内CT15-35,CT值才比较稳定,CT值大于35受到泊松分布概率的影响,CT值呈现一定的随机性。


参考资料:

  1. CLSI: Harmonized Terminology Database. Accessed March 30, 2021. https://htd.clsi.org/listterms.asp?searchdterm=reproducibility&button=Submit

  2. Ginzinger DG. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol. 2002;30(6):503-512. doi:10.1016/S0301-472X(02)00806-8

  3. Is there variability in Ct values? doi:10.1093/cid/ciaa1199

  4. IDSA and AMP Joint Statement on the Use of SARS-CoV-2 PCR Cycle Threshold (Ct) Values for Clinical Decision-Making.

  5. First WHO International Standard for SARS-CoV-2 RNA. Accessed April 22, 2021. https://www.nibsc.org/products/brm_product_catalogue/detail_page.aspx?catid=20/146

  6. Binnicker MJ. Challenges and controversies to testing for COVID-19. J Clin Microbiol. 2020;58(11). doi:10.1128/JCM.01695-20



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