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科普 | 核酸扩增试剂常用酶原料

2021-12-23 22:23:14
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文章来源:IVD技术咖 

作者:柳醉AI



酶,作为核酸扩增检测试剂的主要原材料之一,其关键作用不言而喻,其在分子诊断产品成本中更是具有举足轻重的影响。而在“国产替代”、“集采”等大环境下,实现核心原料国产化的企业,也将拥有更多的机会与主动权。现在,我们不妨先看看核酸扩增的常用酶有哪些?




一、PCR常用酶

1.尿嘧啶DNA糖基化酶

尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)又称尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶),可水解含尿嘧啶的单链和双链DNA释放出游离尿嘧啶,而对RNA无活性,与dUTP搭配使用,可建立成PCR防污染体系。其原理如下:在PCR体系中将dTTP部分或全部替换为dUTP后,使得反应生成含有dU碱基的扩增产物,这些扩增产物不同于天然模板,在进入含有UDG酶的反应体系时,可被UDG酶识别并切割尿嘧啶碱基与糖磷酸骨架间的N-糖基键,而经切割后的DNA链在碱性或高温条件下易于断裂降解,从而失去被当作模板再扩增的能力,因此可防止扩增子污染

                                 

市面上的UDG酶主要有普通型和热敏型,其中热敏型UDG酶在室温条件下即可催化反应,50℃以上加热可使其灭活,防止其降解后续PCR形成的含dU扩增产物。

虽然UDG/dUTP体系具有防污染功能,但在实际测试中还得兼顾PCR的效率和灵敏度。一方面需确保PCR扩增产物掺入足够量的尿嘧啶碱基,从而可被UDG有效切割;另一方面也需要保证反应体系添加的dUTP不会明显影响PCR效率,因此dTTP和dUTP的最 佳比例需通过优化确定。


2.逆转录

逆转录酶又称反转录酶,是一种RNA介导的DNA聚合酶,其反应过程中体现出三种功能为:①以RNA作为模板合成互补DNA链 (complementary DNA, cDNA),形成RNA:cDNA杂交链;②发挥RNase H活性,降解RNA:DNA杂交链中的RNA模板;③以cDNA作为模板合成第二链DNA,形成双链DNA


其中,RNaseH活性是逆转录酶的一个内在特性,可在合成过程中同时切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板,该特性可能降低逆转录效率,因此在实际应用中,常采用人工改造后的低或无RNase H活性的逆转录酶。常用的逆转录酶有AMV和M-MLV,AMV分离自禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus, AMV),M-MLV逆转录酶分离自莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV),前者热稳定性优于后者,但AMV逆转录酶的RNaseH活性也更强,不利于长片段cDNA合成。市面上多使用经基因工程改造过的M-MLV逆转录酶,其热稳定性改进,可在50℃左右工作,同时RNase H活性进一步减弱,提高了其逆转录效率。


3.Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从水生噬热杆菌(Thermus aquaticus)中提取获得的热稳定DNA聚合酶,可以DNA作为模板合成DNA。因其出色的热稳定性,可结合温度循环变换过程,在体外完成DNA的复制。目前体外诊断试剂常用具有热启动(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶,该类酶通过修饰抑制其在低温条件下的活性,防止其在未达到预设温度时出现非特异性扩增,只有在温度升高后,解除抑制,才释放酶活性,从而进入PCR循环扩增过程。常用的TaqDNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、抗体修饰和配体修饰。

化学修饰一般采用化学反应使一些化学小分子(如酸酐等有机物)与聚合酶上的侧链氨基酸(赖氨酸)反应封闭酶活性,只有温度升高后,酸酐与氨基之间的化学键断裂,才表现出DNA聚合酶活性。一般情况下,化学修饰的聚合酶高温启动时间相对较长。

抗体修饰是在Taq DNA聚合酶中添加抗体封闭其活性,使其在低温下无法启动扩增,直至反应体系温度升高使得抗体变性脱落后,DNA聚合酶才被释放活性并启动扩增。抗体修饰的酶活性释放速度快,但抗体与Taq DNA聚合酶的配比需通过优化确定,以便两者达到动态平衡过程。

配体修饰主要借助核酸适配体封闭酶活性,该类适配体多为一段具有特异性识别功能的寡核苷酸分子,可形成特定的空间构象,通过非共价键与Taq DNA聚合酶结合,进而抑制其在非许可温度下的聚合反应。配体修饰的聚合酶活性是可逆的,且热激活温度相对较低。如下图所示的配体修饰酶,在温度达到60℃时则释放DNA聚合酶活性;当温度降低至55℃以下时,则酶活性又可被重新封闭


4.NEAR相关酶

切口酶扩增反应(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)是一种基于切刻内切酶切割特性的恒温扩增方法,详细原理可参考啥黑科技可10分钟完成核酸分子检测?

其使用的酶有两种:①切刻内切酶:如Nt.BstNBI切刻内切酶,该类酶不同于常规限制性内切酶,其识别特定序列后仅在DNA其中一条链上切割形成缺口,并暴露出游离的3’端;②DNA聚合酶:如Vent (exo-) DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶,用于DNA链合成,同时具有链置换功能。


5.HDA相关酶

解旋酶依赖性扩增技术(Helicase-Dependent Amplification, HDA)也是一种多酶协作的反应体系,详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA

反应体系的三个主要酶是:①解旋酶:如UvrD解旋酶,用于解开DNA双螺旋结构,以便形成单链;②单链DNA结合蛋白:可与解链后的DNA单链结合,稳定单链结构;③DNA聚合酶:催化合成DNA链,常用Bst聚合酶或Klenow聚合酶等。


6.RCA相关酶

滚环核酸扩增技术(Rolling Circle Amplification , RCA)是模拟自然界微生物环状DNA滚环复制过程的检测方法,其模板进入扩增前需为环状结构,详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA

RCA使用的是具有强链置换和连续合成特性的φ29 DNA聚合酶;而对于线性模板,还需利用DNA连接酶催化反应形成环状模板后方可进入扩增;此外,该方法无需使用逆转录酶即可用于检测RNA。


7.SDA相关酶

链替代扩增技术(Strand Displacement Amplification, SDA)扩增原理类似于NEAR,只是选择了限制性内切酶对DNA酶切位点进行切割,详细原理可参考充满想象力的恒温扩增技术:RPA、RCA、SDA、HDA

该体系含有两种酶:①限制性内切酶:如限制性内切酶HincII,用于特异性识别酶切位点并切割DNA链,但由于反应中引入化学修饰的碱基,因此只切割其中一条酶切位点未被修饰的DNA链,从而仅形成切口;②DNA聚合酶:如Klenow (exo-) DNA聚合酶,用于DNA链合成,同时具有链置换功能。


三、双功能酶

1.Tth DNA聚合酶

Tth DNA聚合酶是分离至嗜热细菌(Thermus thermophilus)的热稳定性酶,兼具逆转录和DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下,主要表现为逆转录酶活性,即以RNA为模板合成DNA;而在Mg2+条件下,则具有较强的DNA聚合酶活性,以DNA为模板合成DNA。由于该酶可耐受较高温度,因此逆转录步骤可在较高温度下进行,但该酶表现出的活性依赖于不同的二价阳离子,在RT-PCR体系中较难兼容,其逆转录酶活性往往达不到预期,因此在实际使用中,有时还需添加逆转录酶确保逆转录效率。


2.RevTaq RT-PCR DNA聚合酶

RevTaq RT-PCR DNA聚合酶是经人工定向改造后的耐高温双功能酶,同时具有逆转录酶和DNA聚合酶活性。该酶不同于Tth DNA聚合酶,其逆转录酶活性无需Mn2+参与,在PCR循环扩增过程中即可同步进行逆转录步骤,实现 “zero-step” RT-PCR。因此其逆转录过程可在较高温度下进行,引物需相应设计为较高的Tm值。


3.Bst 3.0 DNA聚合酶

Bst 3.0 DNA聚合酶是在Bst DNA Polymerase I(大片段)基础上改造并融合了新型的核酸结合域,使其等温扩增效率提高,逆转录活性也增强,因此可直接用于单酶体系的RT-LAMP


四、小结

对于RNA模板,通常需加入逆转录酶参与扩增反应,该酶的活性也直接决定了检测的效率。虽然市面上也有包含逆转录酶活性的双功能酶,但其应用范围依然较小。不过,双功能酶实现RNA的单酶检测,抑或“零步法”RT-PCR,总让人充满期待。

多酶系统直接增加了原料成本,在体系优化上也提高了难度,但也正是多个酶的巧妙组合,才成就了各种各样的恒温扩增方法。

另外,人工定向改造,也为酶功能带来了无限可能,更是在扩增检测方法上,给人带去更多的想象力。



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珠海宝锐生物科技有限公司成立于2012年,专注于核酸断试诊剂核心原料领域,是珠海市独角兽种子企业、国家高新技术企业。成功研制了多个系列的高品质分子诊断用酶和配套试剂,已得到众多国内知名企业和研究机构的认可,并广泛应用在诊断试剂的研发和生产中。同时,宝锐大力投入mRNA疫苗原料、NGS建库试剂、数字PCR扩增试剂、STR多重检测试剂等多项研究,相关新品陆续上市。

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